《蜘蛛侠3》有三个大反派：毒液人、沙人和绿魔二代，沙人是本集中的头号大坏蛋，他那发亮的身体，能够变成像沙一样的物质，到处流窜；而毒液人则是在蜘蛛侠身体中注射进一种外层空间陨石物质，让蜘蛛服变黑，虽然表面上蜘蛛侠的功力增强不少，但事实不然，毒液人其实就像是坏蛋版的蜘蛛侠，他的衣服胸口也有蜘蛛图案；绿魔二代则是第一集绿魔死后，绿魔儿子哈利接下来扮演的复仇角色。

　　在《蜘蛛侠3》中，只有在开头和结尾的部分，蜘蛛侠才会穿上原本的红蓝色蜘蛛服，而在电影的大部分时间中，蜘蛛侠都是以黑色造型出现，而蜘蛛侠和女友的感情也更进一步，只不过电影内容已暗示，二人最后似乎会以悲剧收场。

　　《蜘蛛侠3》中蜘蛛侠的亲人会过世，影迷本以为是蜘蛛侠的女友，其实不是，最后死的一个是蜘蛛侠的婶婶，另一个则是蜘蛛侠的好友哈利。虽然哈利在片中，有一度为了报父仇而跟蜘蛛侠展开大战，但最后他还是良心发现，以绿魔二代之姿和蜘蛛侠一起攻打毒液人和沙人，只不过最后没能存活下来。

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